@MacElch und andere Biologen: Enzymaktivität?!

Dieses Thema im Forum "Small Talk" wurde erstellt von ihans, 17. September 2004.

  1. ihans

    ihans New Member

    Moin Biologen!
    kurze Schilderung des Versuchs:
    Es wird über ein Enzym 14C-Glycin zu 14CO2 umgesetzt. Das ganze messe ich über Szintilationszähler, 10min,20...60min Dabei bekomme ich einen linearen Anstieg in Form von CPMA. Wie berechne ich jetzt nun die Aktivität?Ne Regressionsgerade erstellen und dann?
    Also 2,22+10hoch6 CPMA = 1 µCi
    Glycin hat ne spez. Aktivität von 56 µCi/mmol
    und ne Konz. von 200µCi/ml
    habe in 500 ml 0,5 µl eingesetzt.
    Alles klar ich dreh durch und mein Doc is in Amsterdam!
     
  2. ihans

    ihans New Member

    ich meinte in 500 µl sind 0,5 µl 14C Glycin
     
  3. macixus

    macixus Hofrat & Traktorist

    Das habe ich mir schon gedacht.
     
  4. ihans

    ihans New Member

    :party:
    Diese verfluchte Diplomarbeit, warum bin ich nicht kfz Mechaniker geworden
     
  5. starwatcher

    starwatcher New Member

    weil du da auf dauer mehr verdienen würdest und armut adelt...
     
  6. MacELCH

    MacELCH New Member

    Hier erstmal eine ungeprüfte Angabe, ich werde nochmals den Voet, Kapitel 13 wälzen.

    Die Konzentration von 200 µCi/ml kann nicht stimmen oder seit wann werden Konzentrationen in Curie angeben ?

    Unter der Annahme, daß es sich um eine Reaktion erster Ordnung handelt und das Substrat nicht limitierend im Versuch vorliegt also [Enzym] << [Substrat] gelten die Michaelis Menten Gleichungen.

    Ich kram gerade in meinem Hirn rum in Zeug was ich schon seit mehr als 10 Jahren gar nicht mehr verwende.

    Die Steigung Deiner Gerade verrät Dir die Aktivität pro Zeiteinheit. Hast Du eigentlich einen Gaschromatographen dranhängen oder mußt Du den background des nicht umgesetzten Substrats von Deiner Aktivität abziehen ?

    Wenn Du am GC messen würdest, würdest Du nur das freigesetzte 14CO2 messen.

    Während ich das hier geschrieben habe, hat meine Frau die richtige Seite für mich aufgeschlagen und meine Vermutungen bestätigt.

    Dir ist Lineweaver-Burk ein Begriff ?

    Hier wird doppelt-reziprok aufgetragen 1/V0 gegen 1/. Beim Schnittpunkt mit der Nullachse kann man 1/Vmax ablesen, was Deiner Enzymaktivität pro Zeiteinhait entspricht. Die Verlängerung der Geraden auf die x-Achse ergibt dann - 1/Km.

    Vielleicht habe ich Dich jetzt noch mehr verwirrt.
     
  7. Convenant

    Convenant Haarfestiger

    Aber genau das ist doch die originäre Aufgabe des Blubberbrettes hier. Mission complete!
     
  8. MacELCH

    MacELCH New Member

    Guten Morgen Herr Convenant, wünsche wohl geschlafen zu haben.
     
  9. Convenant

    Convenant Haarfestiger

    Wollja! Danke! Ebenso!
    :party:
     
  10. MagicBerlin

    MagicBerlin New Member


    Dann will auch mal etwas zur Verwirrung beitragen:

    Kalr kann man µCurie / ml als Konz. angeben. Demnach hat also iHans bei einer spez. Aktivität von 56µCi/mmol 3.57mmol/ml. Und in seinem Ansatz 1.7µmol.
    Was ich nur nicht ganz kapiere, das heute noch mit Curie hantiert wird und nicht mit Bequerel gerechnet wird.
     
  11. macixus

    macixus Hofrat & Traktorist



    Naja ELCH, ich meine, über pure Selbstverständlichkeiten müssen wir uns hier nicht mehr unterhalten. Wenn ich da an meine Enzymaktivität denke, dann ergibt die Verlängerung auf die x-Achse lockere -3/km. Grüße deine Frau sehr herzlich von mir und den Lineweaver-Burk. Ist nämlich ein entfernter Verwandter vom Destillier-Joe hier gleich um die Ecke. Ja, die Welt ist klein.

    Biologen-Grüße nach drüben.

    :bart:
     
  12. ihans

    ihans New Member

    So erstmal Danke!
    Das bringt mich doch schon weiter:
    Also der Versuch läuft so ab:
    Ich habe ein Warbutggefäß, da is im Seitenarm das Reaktionsgemisch mit Protein+14C-Glycin+restl Zeugs.Im Boden ist NaOH.
    Wenn ich die Reaktion stoppe (Zugabe von 50%iger TCA) wird das 14CO2 aus getrieben und in der NaOH aufgefangen, davon gebe ich 500µl in 5ml Szintilatorcocktail und vermesse die ganze Grütze-erfolgreich (-;
    MagicBerlin-das ist vollkommen richtig! Wenn ich dann das ganze vermesse (1 Wert für 10min, 1 Wert für 20min...), bekomme ich Werte in CPMA (counts per minute) ausgegeben, wie kann ich denn nun eine Aktivität in nmol/sec erhalten?
    Ich mach erstmal meine Einleitung fertig....
     
  13. MagicBerlin

    MagicBerlin New Member

    Hallo iHans,

    Ich habe diese bestimmung noch nicht gemacht. Aber etwas erfahrung in Aktivitätsmessungen. Messung von weichen Isotopen in biologischer matrix. Was man eben im Pharmforschungsbereich so macht...
    Ich würde auf jeden fall nicht cpm sondern dpm messen. Mit anderen Worten: den Quench der Probe berücksichtigen. gerade bei NaOH Proben haut dir ein Quench rein der dir die Ausbeute des LSC bei 14C von rund 90 % auf deutlich niedrige Werte bringt (im schlimmsten fall bis auf 5%). Und dann stimmt die ganze rechnung vorne und hinten nicht.
    Und wenn ich das alles recht verstanden habe, hast due mehrere Ansätze, die zu bestimmten Zeiten gestoppt, das CO2 ausgetrieben, aufgefangen und gemessen. daraus müsste sich eine Grafik bilden lassen, die irgendwo linear ist. den bereich nimmt man sich und hat dann den zuwachs an Aktivität / Zeiteinheit. Jetzt nur noch über die spez. Aktivität (µCi/mmol) die RA Aktivität in mmol umrechnen und das dürfte es gewesen sein.
     
  14. ihans

    ihans New Member

    "...die irgendwo linear ist. den bereich nimmt man sich und hat dann den zuwachs an Aktivität / Zeiteinheit. Jetzt nur noch über die spez. Aktivität (µCi/mmol) die RA Aktivität in mmol umrechnen und das dürfte es gewesen sein"
    Wau! Genauso siehts aus, habe einen linearen Anstieg, ist der Zuwachs an Aktivität/Zeiteinheit denn der Anstieg? Kannste mir das mal genauestens erklären...BitteBitte! Ich stell mich zu doof an!
     
  15. MagicBerlin

    MagicBerlin New Member

    die Differenz an RadioAktivität zwischen den zeitpunkten ist das umgesetzte Glycin Aliquot. man brauch also nichts weiter zu machen, als die Differenz an Radioaktivität zu berechen. Dann von den 500µl zur LSC Messung eingesetzten auf das Gesamtvolumen der NaOH hochrechnen. Jetzt hast Du einen Radioaktivitätswert (x µCi) der Gesamtproduktion an CO2 aus 14C Glycin in diesem Zeitraum. jetzt nur noch über die spez. Aktivität (µCi / mmol) die dpm in mmol berechnen. Dabei beachten:
    1. Das Glycin war unverschnitten ?
    2. Umsetzung erfolg zu 100% ?
    3. Die Ausbeute des LSC bei der Messung NaOH-Lsg.

    Zur Kontrolle hätte man auch noch ein Aliquot des Ansatzes messen und das Pferd von der andeern Seite aufziehen können.
     
  16. ihans

    ihans New Member

    That´s it! Danke (-: Da kann ich mir ja noch nen schönen Sonntag machen...Auf alle Fälle kann ich jetzt weitermachen!

    Glycin 98,9% rein
    NaOH vermessen
    Gesamtaktivität an eingesetzten Glycin wurde auch vermessen.
     
  17. Macmacfriend

    Macmacfriend Active Member

    Ich hätte 98,92% Glycin genommen. :bart:
     
  18. MacELCH

    MacELCH New Member

    Na dann scheint Dein Problem wohl gelöst zu sein.

    Viel Spaß beim Schreiben !
     
  19. ihans

    ihans New Member

    Danke nochmals!
    Habe Einleitung, Material & Methoden und Ergebnisse fertig!!!Jetzt nur noch Diskussion und Kleinkram, das wars!!!!
     

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